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His标签蛋白纯化填料支持物为Ni-IDA CL-6B琼脂糖凝胶，载量为20mg 6×His标签蛋白/mL填料。本制品已螯合镍离子，可直接用可溶性蛋白的纯化，使用方便，快捷。填料可重复使用。

Ni-IDA亲和层析介质是把IDA(亚氨基二乙酸)共价偶联到4%交联的琼脂糖介质上，再通过IDA的3个结合位点螯合Ni2+制备而成，并提供了三个离子键结合部位高亲和地纯化含有多聚组氨酸标签的重组蛋白。Ni-IDA亲和层析介质的Ni2+脱落程度很低，并具有高吸附量及高稳定性，在多聚组氨酸标签的重组蛋白的纯化实验中有非常好的表现力。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统(如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌)中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。

• 样品中不能含有β-巯基乙醇、DTT和EDTA、EGTA等。
  
• 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
  
• 为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，Binding Buffer的范围为0～10mM，洗脱缓冲液的范围为10～500mM来进行。并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
  
• 请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22μm或者0.45μm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22μm或者0.45μm过滤器过滤。
  
• 柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

• 平衡缓冲液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，用NaOH调pH为8.0。
  
• 洗涤缓冲液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，用NaOH调pH为8.0。
  
• 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，用NaOH调pH为8.0。

• 将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
  
  • 填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每mL填料纯化20～30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
    
  • 如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
    
  • 本实验都是通过重力作用使溶液流出。
• 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
  
  • 柱体积指的是填料的体积。

• 收集菌体后，每100mg菌体(湿重)加入1～5mL细菌裂解液(每1mL细菌抽提试剂中已加入10μL蛋白酶抑制剂混合物)，超声裂解菌体。
  
  • 当提取物粘度高时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1mL细菌抽提试剂中加入1μL DNase I(1,000U/mL)，2μL Lysozyme(50mg/mL)，DNase I和Lysozyme可单独从我司购买，如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。
    
  • 超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。
• 10000rpm,4℃离心3分钟，收集上清中的可溶性蛋白。
  
• 用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
  
  • 本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
    
  • 通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。
• 使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
  
• 使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
  
  • 洗脱峰可以分管收集，每1mL收集1管，并采用蛋白监测仪监测，收集洗脱峰。
• 洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。
  
  • 如果是分段梯度洗脱，最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500mM时，则使用浓度为500mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后，再进行第6步的操作。

• 使用2倍柱体积的6M盐酸胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
  
• 使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
  
• 依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗。
  
• 使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
  
• 使用5倍柱体积含50mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
  
• 使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
  
• 置2～8℃保存。
  
• 再次使用前，需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50mM NiSO4再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。
  
• 为了长时间的保存，介质应当2～8℃保存在1×PBS(含20%乙醇)中。

• 纯化的组分中没有His标签的蛋白?
  我们可以根据检测上柱前蛋白，流穿液蛋白，和洗脱液蛋白的检测，来进行基本的判断。是否包涵体蛋白？是否标签没有表达出来：可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合；或者标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上；蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2～5mM巯基乙醇避免沉淀。
  • 若His标签蛋白没有结合上去都流穿了，可能原因：
    
    • 柱子没平衡好
      改进方法：建议先用500mM的咪唑平衡，在用你的平衡液平衡。另外平衡液，上样液的缓冲液要一致，比如20mM Tris-HCL PH8.0,200mM氯化钠，20mM的咪唑。
      加氯化的目的是减少离子结合，加咪唑的目的减少非特异性吸附，氯化钠浓度可在200～400mM之间。
      
    • 超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)
      改进方法：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶
      
    • 样品或者是结合缓冲液不合适：
      改进方法：检测pH及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。甚至可以不含咪唑。
      样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致，避免沉淀，通常再偏碱性条件下吸附更好。
      
    • 组氨酸的标签没有完全的暴露，被折叠在蛋白的结构内改进方法：在变性条件下(用4-8M脲，或4-6M盐酸胍)进行纯化。
      
    • HIS标签丢失
      改进方法：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。
      WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or N-terminal)，必要时增加his个数(常用6～10个)。
  • His标签蛋白没有洗脱下来，如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，可能的原因：
    
    • 洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强)
      改进方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH来找出最佳的洗脱条件。
      用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱。
      
    • 降低PH的方法洗脱的，因为若PH低于3.5，会导致镍离子脱落
      改进方法：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱
      
    • 蛋白已沉淀在柱上
      改进方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4-8M脲，或4-6M盐酸胍)。
      
    • 非特异性疏水或其他相互反应
      改进方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如，2%Triton X-100)或增加NaCl的浓度。
• His标签蛋白洗脱后杂带较多?
  His亲和特异性弱，原因在蛋白中带组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近这样也会使它们和镍柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱，此外在咪唑洗脱前增加一步0.5M pH5的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一个步骤，不仅仅是纯化的问题。还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1～2mM巯基乙醇避免。
  
  • 上样量太大，且清洗的不到位，1mL镍柱的蛋白结合量也就30～40mg之间，可以根据这个估算上样量，上样量一般不超过蛋白结合量的50%，因为要给杂蛋白留出一些位点。上样完了，要用平衡缓冲液清洗，目的是把没结合的物质及过量的可结合的物质冲出柱子，这个一定要清洗干净，后续才能得到较好的纯度。
    
  • 目的蛋白的表达量太低
    改进方法：提高目的蛋白的表达量。通过改变宿主菌菌株类型，IPTG浓度，诱导温度，时间长度来实现。也可以通过构建新的载体来尝试提高表达量，但这个方法和前面几种相比耗时较长，也不一定有用。如果目的蛋白表达量大了，挂镍柱时竞争优势就会提高，自然纯度就会很高。
    
  • 标签蛋白降解
    改进方法：添加蛋白酶抑制剂，(不能用EDTA、EGTA)。
    
  • 杂质对镍离子有更高的亲和性
    改进方法：
    
    • 咪唑浓度必须优化，以确保高纯度(宿主细胞蛋白质的低结合)和高产率(组氨酸标记的目标蛋白质的强结合)之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑；
      咪唑的梯度不大(20个或更多的柱床体积)，可能分离出有相似结合强度的蛋白。
      
    • 筛选最适合的缓冲液条件，NaCl浓度，PH的范围都需要进行筛选以下是(His)6-NuRR1蛋白在His MultiTrapFF 96孔板上进行缓冲液条件的筛选以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成96个不同的混合配方。实验结果显示对于该目标蛋白在25mM Tris，10mM NaCl，10％甘油，pH8.5的缓冲液适最佳的结合条件。
      
    • 若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白，需要考虑多步纯化的思路，离子交换(HiTrap Q HP or HiTrap SPHP)和凝胶过滤。
  • 杂质和标签蛋白结合在一起
    改进方法：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂；增加去垢剂的浓度，(2% Triton X-100 or 2% Tween 20)；或者在wash buffer中增加甘油的浓度(50%)减少非特异性的相互反应；考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。
    
  • 洗涤不充分
    改进方法：增加洗涤的次数，使洗涤充分。
    
  • 洗脱后有杂带，binding buffer中也有目的条带
    
    • 检测pH及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高，甚至可以不含咪唑的。洗脱可以梯度洗脱，咪唑浓度可以从20～500mM从低到高洗脱，不同的蛋白洗脱条件肯定不可能都是一样的，自己先摸下条件。设置咪唑梯度洗脱。可用不同浓度梯度的咪唑洗脱目的蛋白，从20mM到500mM，期间设定不同的浓度梯度。如果有梯度洗脱系统，可以用连续的咪唑梯度可更有效地去除杂蛋白。
      
    • 为了减少非特异性蛋白与树脂的相互作用，所有的buffer应该有足够的离子强度，300mM-2M氯化钠。